Marvel's Spider-Man se déroule quelque part dans l'univers Marvel, où Peter Parker incarne l'homme araignée depuis déjà un certain temps. Il n'y a pas de transformation des pouvoirs ou quoi que ce soit durant l'aventure, au contraire, dès le début du jeu, vous entrez directement dans l'action. Un groupe de vilains connus sous le nom de The Demons terrorise la ville de New York. Mené par Martin-Li, également appelé Mister Negative, le jeu s'ouvre lentement devant vous. Spider-Man fait face à la menace la plus meurtrière qu'il n'est jamais connu avec les Sinister Six qui incluent Scorpion, Electro, Rhino, Vulture, Mister Negative et un autre ennemi surprise qui veut détruire New York City, morceau par morceau. Alors que ces méchants sont dans la nature, Peter Parker a besoin de jongler avec la vie quotidienne de Spider-Man et être simplement le geek talentueux qu'il est dans le civil, travaillant au laboratoire scientifique d'Otto Octavius et aidant sa Tante May au refuge appelé F.E.A.S.T. Tout au long du jeu, vous rencontrez des personnages fantastiques, vous les voyez grandir et parfois tirer leurs révérences.